フローサイトメトリーを最適化するためのサンプル調製については、多くの注意すべき点があります。最初に出発材料（サンプルソース）が挙げられます。例えば、凍結保存しておいた細胞は、培養容器から回収した直後の細胞とは異なる方法で処理する必要があるなどです。それでも、ほとんどのサンプルには実験を最適化するのに役立ついくつかの基本的なルールがあります。
- 細胞を凍結保存していた場合は、可能な限り迅速に細胞を解凍し、BSAまたはFCS（Fetal Calf Serum:牛胎児血清）を含む大量の低温培地またはPBSに再懸濁することによってDMSOを除去する。抗原の発現を回復するために、解凍後に細胞を培養する必要がある場合もあります。
- 接着細胞は、継代の際よりも穏やかな処理が必要な場合があります。 トリプシンはしばしば細胞を破壊し、細胞片(debris)をたくさん作り、抗原を破壊する厳しい処理です。 単細胞浮遊液を作製するには、さらに穏やかな方法が必要とされることもあります。
- 脾臓やリンパ節などの組織を機械的に分散する際、過度に強くしないように注意してください。 サンプルをフィルター処理することで、不要な細胞の塊を取り除くことができます。
- 二次リンパ組織から、F4/80陽性マクロファージや濾胞性樹状細胞などを抽出する場合は、コラゲナーゼやリベラーゼのような酵素の添加が必要です。しかしながら、抗原が除去されてしまうこともあるので、最適化が必要な場合があります。
- 不要物は除去します。例えば骨から骨髄を洗い出すときは、できるだけ多くの筋肉を除去してください。 再度フィルター処理することで、不要な骨や筋肉を取り除くことができます。
- 末梢血サンプルからの赤血球の除去は、赤血球溶解緩衝液（BUF04B）を用いた低張溶解を使用によって行うことができます。 サンプルをバッファー中で長時間放置しないように注意してください。 あるいは、密度勾配遠心分離を使用することができます。遠心分離後、白血球は高密度液体の界面に捕捉され、赤血球は通過します。ただし、顆粒球も界面を通過するので、そうした細胞を目的とする場合には、この方法は適していません。
- ボルテックスや過剰な遠心分離を避け、沈殿した細胞を乾燥させないように注意してください。 再懸濁する際の過剰の泡立ちや、高濃度での懸濁は、細胞死を増加させます。細胞を氷上に保つことは、壊死や細胞代謝が低下するため、生存率を高めます。
- 細胞を調製するのにかかる時間が細胞の生存率に大きな影響をおよぼすことがあるため、すべてのサンプル調製はできるだけ手早くする必要があります。